Роден е на 1 март 1879 г. в Славовица, Пазарджишко. Александър Стамболийски учи в земеделското училище в Садово (1893 – 1895) и завършва Лозаро-винарското училище в Плевен (1895 – 1897). В Плевен е ученик на основателя на Българския земеделски съюз (БЗС) Янко Забунов. През 1899 г. участва в учредителния конгрес на БЗНС. През следващите години учи философия в Хале и агрономия в Мюнхен, но прекъсва образованието си поради заболяване от туберкулоза.
След завръщането си в България се занимава с политическа дейност. През 1908 г. Александър Стамболийски е избран за народен представител от БЗНС. Той се превръща във фактически водач на БЗНС и под негово влияние съюзът е преобразуван от съсловна организация в политическа партия. Под негово въздействие БЗНС провъзгласява лозунга за самостоятелна селска власт, която трябва да защитава „общоселските интереси”.
Републиканец и пацифист по убеждения, Стамболийски остро се противопоставя на промените в Търновската конституция през 1911 година и на участието на България в Първата световна война. След скандал при среща с Фердинанд през 1915 година, където категорично осъжда плана на Фердинанд България да се включи в Първата световна война на страната на Централните сили, Стамболийски е отстранен от парламента и осъден на доживотен затвор.
По време на Войнишкото въстание през септември 1918 г. спешно е освободен и е изпратен заедно с други политици да води преговори с въстаниците за мирно разрешаване на конфликта. Под влияние на своя сътрудник Райко Даскалов решава да оглави въстанието и бива провъзгласен за председател на т.нар. Радомирска република. След неуспеха на бунта се укрива, но през декември 1918 г. е амнистиран заедно с повечето участници.
През януари 1919 г. Стамболийски се включва в коалиционното правителство на Теодор Теодоров. Участва в преговорите за сключване на мирен договор на Парижката конференция. След отказа на Теодоров да приеме наложените условия, Стамболийски оглавява правителството на 7 октомври 1919 и на 27 ноември 1919 г. подписва Ньойския договор, след което, според някои сведения, счупва писалката. След парламентарните избори от 21 май 1920 г. правителството е съставено само от представители на БЗНС.
Към началото на 1923 г. режимът на Стамболийски започва да губи влияние извън средите на българското селячество. На 4 февруари е извършен неуспешен атентат от ВМРО срещу него и министрите Александър Оббов, Петър Янев и Цанко Бакалов в ложата на Народния театър. Подписването на Нишката спогодба от 23 март 1923 г. с Кралството на сърби, хървати и словенци за „обезопасяване на границата” между двете държави прелива чашата на търпението. Носят се слухове, че са водени тайни преговори за Балканска федерация, в която България ще е под егидата на Сърбия.
Срещу Стамболийски се настройват голяма част от интелигенцията, македонските организации, белогвардейците, военните, буржоазните партии, комунистите. На 9 юни 1923 г. срещу правителството на Стамболийски е извършен военен преврат, организиран от Военния съюз с подкрепата на буржоазните партии и царя.
По време на преврата Стамболийски се намира в родното си село Славовица и не успява да реагира адекватно. Междувременно в страната избухва стихийно селско вълнение в подкрепа на Стамболийски, останало в историята като Юнско въстание. Най-голяма сила то придобива в Плевенско и Шуменско. Плевен дори е обсаден и частично завзет от селските дружини. В крайна сметка бунтовете са потушени от военния гарнизон и други сили, верни на новата власт в София.
Сам Стамболийски организира няколко хиляди селяни и местни и прави опит за обсада на Пазарджик. Заповед за нападение не е дадена. Силите са неравни и след като местният гарнизон не се подчинява на законния министър-председател, на 11 юни Стамболийски разпорежда на селяните да се пръснат, за да не се стигне до по-нататъшни кръвопролития.
Още на 10 юни военният министър Иван Вълков дава устна заповед на капитан Иван Харлаков да залови и убие Александър Стамболийски. Капитанът заминава с група военни за Пазарджик, където операцията по залавянето на Стамболийски вече се ръководи от полковник Славейко Василев.
Стамболийски прави опит да се добере до двореца в Кричим, но на 13 юни е заловен при село Голак, след което е отведен в Пазарджик. Там Василев отказва да предаде Стамболийски на Иван Харалаков. Спорът между двамата е под чия команда той да бъде отведен в София, като Василев е осигурил за целта специален влак, който чака на гарата.
След нареждане по телефона Стамболийски да бъде предаден на Харлаков, последният го качва на автомобил и го отвежда обратно във вилата му в Славовица. Там той е убит по най-жесток начин от група членове на ВМРО, водена от скопския войвода Величко Велянов. Тялото му е обезобразено до неузнаваемост и четниците се гаврят с него.
Родната къща на Стамболийски, както и вилата му в село Славовица днес са музеи. На негово име е наречен град Стамболийски, намиращ се приблизително по средата между Пловдив и Пазарджик.